Resistencia a medicamentos en mycobacterium tuberculosis: contribución de mecanismos constitutivos y adquiridos / Drug resistance in mycobacterium tuberculosis: contribution of constituent and acquired mechanisms

RESUMEN En presencia de aislamientos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) multifármaco-resistentes (MTB-MDR) y con resistencia extendida (MTB-XDR) las tasas de fracaso de los esquemas estandarizados de tratamiento son altas, constituyéndose en un verdadero problema de salud pública a nivel mundial. La fármaco-resistencia en MTB se debe principalmente a mutaciones en genes blanco; sin embargo, una proporción de aislamientos fármaco-resistentes no presentan mutaciones en dichos genes, sugiriendo la participación de otros mecanismos, tales como permeabilidad reducida de la pared celular, modificación enzimática y/o bombas de eflujo. La resistencia clínica a los medicamentos anti-tuberculosos (anti-TB) ocurre en gran parte como resultado de la selección de mutantes resistentes durante la falta de adherencia del paciente al tratamiento, inapropiados seguimientos y prescripción médica, dosis subóptimas de fármacos y dificultad de acceso a los servicios de salud y al tratamiento. Los Avances de la biología molecular y la secuenciación del genoma de MTB han contribuido a mejorar el entendimiento de los mecanismos de resistencia a los principales medicamentos anti-TB. Un mejor conocimiento de los mecanismos de fármaco-resistencia en MTB contribuirá a la identificación de nuevos blancos terapéuticos, al diseño de nuevos medicamentos, al desarrollo de nuevos métodos diagnósticos y/o mejorar las técnicas que actualmente están disponibles para la detección rápida de TB fármaco-resistente. Este artículo presenta una revisión actualizada de los mecanismos y las bases moleculares de la resistencia de MTB a medicamentos anti-TB.(AU)

ABSTRACT Due to the emergence of multi-drug resistant (MDR-MTB) and extensively drug-resistant (XDR-MTB) Mycobacterium tuberculosis (MTB) isolates, the failure rates of standard treatment regimens are high, thus becoming a major public health challenge worldwide. Resistance to anti-tuberculous (anti-TB) drugs is attributed mainly to specific mutations in target genes; however, a proportion of drug-resistant MTB isolates do not have mutations in these genes, which suggests the involvement of other mechanisms, such as the low permeability of the mycobacterial cell wall, enzymatic modification and/or efflux pumps. Clinical drug resistance to anti-TB drugs occurs largely as a result of the selection of resistant mutants caused by poor patient adherence to treatment, inappropriate follow-ups and prescriptions, suboptimal doses of drugs and poor access to health services and treatment. Major advances in molecular biology tools and the availability of the complete genome sequences of MTB have contributed to improve understanding of the mechanisms of resistance to the main anti-TB drugs. Better knowledge of the drug-resistance of MTB will contribute to the identification of new therapeutic targets to design new drugs, develop new diagnostic tests and/or improve methods currently available for the rapid detection of drug-resistant TB. This article presents an updated review of the mechanisms and molecular basis of drug resistance in MTB.(AU)

Estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección de strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal / Standardization of a real-time polymerase chain reaction (qPCR) for the detection of strongyloides stercoralis in stool samples

Introducción: el diagnóstico de estrongiloidiasis se realiza de rutina en los laboratoriosclínicos; sin embargo, su detección se dificulta debido a la baja excreción parasitaria y la baja sensibilidad de las pruebas parasitológicas empleadas. Objetivo:diseñar y estandarizar una PCR en tiempo real (qPCR) para la detección de ADN de Strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal. Materiales y métodos: se establecieron las condiciones de qPCR y se evaluaron: a) la especificidadanalítica mediante análisis BLASTn de secuencias obtenidas de muestras positivas para Strongyloides stercoralis, b) sensibilidad analítica mediante dilucionesseriadas de muestras que contenían larvas de Strongyloides stercoralis y c) la ocurrencia de reacciones cruzadas con otros parásitos e inhibidores de la amplificación. Resultados: se amplificó un fragmento de 101 pb del gen 18S del ARN ribosomal. El valor de Ct osciló entre 23 y 29, tomando un Ct ≤35 como el punto de corte para muestras positivas. El análisis BLASTn de las secuencias obtenidas mostró un porcentaje de identidad del 98% con secuencias 18S del ARN ribosomal de Strongyloides stercoralis reportadas en la NCBI. El límite inferiorde detección de la qPCR fue 0,9 ng/μL. No se evidenció reacción cruzada con Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Uncinarias, Hymenolepis nana, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Giardia intestinalis e Iodamoeba bütschlii. No se detectaron inhibidores en las muestras de materia fecal. Conclusiones: la sensibilidad y la especificidad analítica de la qPCR comparado con el examen directo de heces son del 100%; sin embargo, aún no es posible interpretar su utilidad clínica.

Introduction: the diagnosis of strongyloidiasis is performing routinely in clinical laboratories; however, its detection is difficult due to low parasitic excretion and low sensitivity of the parasitological tests employed. Objective: to design and standardize a real-time PCR (qPCR) for the detection of Strongyloides stercoralis DNA in stool samples. Materials and methods: qPCR conditions were established and it were assessed: a) analytical specificity by BLASTn analysis of sequences obtained from samples positive for Strongyloides stercoralis, b) analytical sensitivity by serial dilutions of samples containing Strongyloides stercoralislarvae and c) the occurrence of cross-reactions with other parasites and amplification inhibitors. Results: a 101 bp fragment of the 18S ribosomal RNA gene was amplified. The value of Ct ranged from 23 and 29, with a Ct value ≤35 as a cut-off point for positive samples. BLASTn analysis of the obtained sequences showed an identity percentage of 98% with 18S ribosomal RNA sequences of Strongyloides stercoralis reported in the NCBI. The qPCR lower limit of detection was 0.9 ng/ μL. There was no cross-reaction with Ascaris lumbricoides, Trichuristrichiura, Uncinarias, Hymenolepis nana, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Giardia intestinalis, and Iodamoeba bütschlii. No inhibitors were detected in the stool samples. Conclusion: the sensitivity and analytical specificity of qPCR compared to direct examination of feces are 100%; however, it is still not possible to interpret their clinical utility.

Agar de capa delgada: Una opción costo-efectiva para el diagnóstico rápido de tuberculosis multirresistente / Thin layer agar represents a cost-effective alternative for the rapid diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis

Objetivo Realizar un análisis de costo efectividad comparando el método de cultivo en agar de capa delgada y el método estándar de proporciones múltiples, utilizados en el diagnóstico de Tuberculosis Multi-drogorresistente (TB MDR). Métodos Estudio de evaluación económica en el cual se evalúan los costos y la efectividad de dos pruebas diagnósticas, ejecutado en la Corporación para Investigaciones Biológicas-CIB en Medellín, Colombia. Resultados Se evaluaron 100 pacientes, encontrando una prevalencia de resistencia a la Rifampicina de 10,8 % y resistencia a Isoniazida de 14,3 %. Se presenta un análisis en términos de costo-efectividad mediante el diseño de un árbol de decisiones (Treeage Pro ®), resultando ser la prueba basada en cultivo en agar de capa delgada más costo-efectiva; con valores de sensibilidad, especificidad y predictivos del 100 % para detectar resistencia a Rifampicina e Isoniazida. El valor del método de las proporciones múltiples fue calculado en US$ 71, con una media de tiempo para ser reportado de 49 días versus US$ 18 y 14 días respectivamente para el cultivo en agar de capa delgada. Discusión Se han desarrollado nuevas tecnologías para el diagnóstico de Tuberculosis, aparentemente más rápidas y efectivas, que deben ser evaluadas no solo en sus características operativas, sino también en términos de costo-efectividad. El presente estudio establece que el empleo de la capa delgada es menos costoso, igualmente efectivo, y puede aportar resultados más rápidamente; cuando se compara con el método tradicional. Esto implica, entre otros aspectos, que el paciente pueda recibir más oportunamente el tratamiento dirigido para TB MDR.

Objective Using cost-benefit analysis for comparing the thin-layer agar culture method to the standard multiple proportion method used in diagnosing multidrug-resistant tuberculosis (MDR TB). Methods A cost-benefit evaluation of two diagnostic tests was made at the Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) in Medellín, Colombia. Results 100 patients were evaluated; 10.8 % rifampicin resistance and 14.3 % isoniazid resistance were found. A computer-based decision tree model was used for cost-effectiveness analysis (Treeage Pro); the thin-layer agar culture method was most cost-effective, having 100 % sensitivity, specificity and predictive values for detecting rifampicin and isoniazid resistance. The multiple proportion method value was calculated as being US$ 71 having an average 49 day report time compared to US$ 18 and 14 days for the thin-layer agar culture method. Discussion New technologies have been developed for diagnosing tuberculosis which are apparently faster and more effective; their operating characteristics must be evaluated as must their effectiveness in terms of cost-benefit. The present study established that using thin-layer agar culture was cheaper, equally effective and could provide results more quickly than the traditional method. This implies that a patient could receive MDR TB treatment more quickly.